實(shí)驗(yàn)室必備｜液相色譜柱核心知識(shí)（原理?規(guī)格?填料?應(yīng)用）！
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一、色譜柱核心原理與性能要求?
色譜技術(shù)的核心在于 “分離”，而承擔(dān)分離功能的色譜柱，堪稱整個(gè)色譜系統(tǒng)的 “心臟”。一款優(yōu)質(zhì)色譜柱需滿足柱效高、選擇性優(yōu)、分析速度快三大核心要求。目前市售高效液相色譜(HPLC)常用填料包括多孔硅膠、硅膠基質(zhì)鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球(含離子交換樹脂)、多孔碳等，粒度規(guī)格多為 3μm、5μm、7μm、10μm，理論柱效可達(dá) 5～16 萬塔板數(shù) / 米。?
實(shí)際應(yīng)用中，常規(guī)分析僅需 5000 塔板數(shù)的柱效;同系物分析 500 塔板數(shù)即可滿足需求;針對(duì)難分離物質(zhì)對(duì)，可選用塔板數(shù)高達(dá) 2 萬的色譜柱，因此 10～30cm 的柱長基本能覆蓋復(fù)雜混合物的分離分析。?
柱效受柱內(nèi)與柱外雙重因素影響。要實(shí)現(xiàn)最佳柱效，除需控制柱外死體積外，還需優(yōu)化柱結(jié)構(gòu)(減少填充床外死體積)并采用規(guī)范裝填技術(shù)。即便裝填工藝精良，柱中心與管壁的填料密度仍存在差異 —— 管壁附近填料較疏松，易形成 “溝流”，導(dǎo)致沖洗劑流速不均、譜帶加寬，這一現(xiàn)象被稱為 “管壁效應(yīng)”，其影響區(qū)域約為管壁向內(nèi) 30 倍填料粒徑的厚度。值得注意的是，在常規(guī)液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。?
1. 色譜柱的構(gòu)造?
色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、固定螺絲等部件組成。柱管材質(zhì)以不銹鋼為主，當(dāng)系統(tǒng)壓力不超過 70Kg/cm2 時(shí)，也可選用厚壁玻璃或石英管，且內(nèi)壁需具備高光潔度以降低管壁效應(yīng)，部分不銹鋼柱會(huì)通過內(nèi)壁拋光或涂敷氟塑料提升光潔度，也有采用熔融硅或玻璃襯里的細(xì)管柱。?
色譜柱兩端的接頭內(nèi)裝有篩板(材質(zhì)為燒結(jié)不銹鋼或鈦合金)，孔徑規(guī)格為 0.2～20μm(常用 5～10μm)，具體取決于填料粒度，核心作用是防止填料泄漏。柱內(nèi)徑的選擇需結(jié)合柱長、填料粒徑及折合流速，核心目的是規(guī)避管壁效應(yīng)。?
2. 色譜柱的發(fā)展趨勢(shì)?
隨著分析效率需求的提升，短柱應(yīng)運(yùn)而生，柱長多為 3～10cm，搭配 2～3μm 粒徑填料，可大幅縮短分析時(shí)間;為適配質(zhì)譜(MS)聯(lián)用、提高檢測(cè)靈敏度，窄徑柱、毛細(xì)管柱及微徑柱(內(nèi)徑<0.2mm) 逐漸普及。細(xì)管徑柱的優(yōu)勢(shì)顯著：①節(jié)省流動(dòng)相用量;②檢測(cè)靈敏度更高;③樣品消耗量少;④可通過加長柱長實(shí)現(xiàn)高分離度;⑤柱溫易精準(zhǔn)控制;⑥便于實(shí)現(xiàn) LC-MS 聯(lián)用。?
但柱體積減小后，柱外效應(yīng)的影響會(huì)更突出，因此需配套使用小池體積檢測(cè)器(甚至柱上檢測(cè))、低死體積柱接頭及連接部件。對(duì)應(yīng)的儀器設(shè)備需滿足：輸液泵能精準(zhǔn)輸出 1～100μl/min 的低流量;進(jìn)樣閥可準(zhǔn)確重復(fù)進(jìn)樣微量樣品;因進(jìn)樣量小，還需搭配高靈敏度檢測(cè)器，其中電化學(xué)檢測(cè)器與質(zhì)譜儀在該場景下表現(xiàn)尤為突出。?
3. 色譜柱的填充技術(shù)?
色譜柱性能不僅取決于固定相本身，還與填充技術(shù)密切相關(guān)。常規(guī)情況下，填料粒度>20μm 時(shí)，適合采用干法填充制備柱;粒度<20μm 時(shí)，濕法填充更易保證柱效。常見填充方法有四種：①高壓勻漿法，廣泛應(yīng)用于分析柱與小規(guī)模制備柱;②徑向加壓法;③軸向加壓法，主要用于大直徑柱裝填;④干法填充。?
柱填充技術(shù)專業(yè)性較強(qiáng)，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室直接使用商品化預(yù)制柱。需強(qiáng)調(diào)的是，高效液相色譜柱的性能優(yōu)化，裝填技術(shù)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但核心仍取決于填料本身的品質(zhì)，以及色譜儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的合理性。?
二、液相色譜柱的規(guī)格分類?
色譜柱按用途可明確分為分析型與制備型兩大類，具體規(guī)格如下：?
① 常規(guī)分析柱(常量柱)：內(nèi)徑 2～5mm，柱長 10～30cm，適用于常規(guī)樣品定量分析;?
② 窄徑柱(narrowbore)：內(nèi)徑 1～2mm，柱長 10～20cm，兼顧靈敏度與流動(dòng)相節(jié)省，常用于微量樣品分析;?
③ 微徑柱(microbore)：內(nèi)徑<0.2mm，柱長靈活可調(diào)，適配 LC-MS 聯(lián)用及痕量分析;?
④ 半制備柱：內(nèi)徑>5mm，柱長 10～30cm，用于少量樣品制備提純;?
⑤ 實(shí)驗(yàn)室制備柱：內(nèi)徑 20～40mm，柱長 10～30cm，滿足實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的樣品制備需求;?
⑥ 生產(chǎn)制備柱：內(nèi)徑可達(dá)數(shù)十厘米，專為工業(yè)級(jí)大規(guī)模樣品提純?cè)O(shè)計(jì)。?
拓展知識(shí)：常見色譜柱填料分類及應(yīng)用?
a、反相(含離子對(duì))色譜常用填料?
C18(十八烷基 / ODS)：普適性最強(qiáng)，保留性能優(yōu)異，是應(yīng)用最廣泛的反相填料;?
C8(辛基)：性能與 C18 相似，但對(duì)目標(biāo)物的保留值略低，適合中等極性樣品分離;?
C3、C4：保留值較弱，多用于肽類、蛋白質(zhì)等生物大分子分析;?
C1(三甲基硅烷 TMS)：保留值最小，化學(xué)穩(wěn)定性較差，僅適用于特定低極性樣品;?
苯基 / 苯乙基：保留值適中，選擇性與烷基鍵合相不同，適合芳香族化合物分離;?
CN(氰基)：保留值中等，兼具正相和反相色譜適用性，應(yīng)用場景靈活;?
NH2(氨基)：保留性較弱，適用于烴類化合物分析，化學(xué)穩(wěn)定性欠佳。?
b、正相色譜常用填料?
CN(氰基)：普適性好，極性適中，是正相色譜的常用填料;?
OH(二醇基)：極性高于氰基填料，適合強(qiáng)極性樣品分離;?
NH2(氨基)：極性較強(qiáng)，穩(wěn)定性不足，多用于特定極性化合物分析;?
硅膠：普適性強(qiáng)，價(jià)格低廉，但操作要求較高，常用于制備型液相色譜。?
c、空間排阻色譜(SEC)常用填料?
硅膠：普適性極佳，主要用作吸附劑;?
硅烷化硅膠：吸附性弱，溶劑兼容性好，適用于有機(jī)溶劑體系的 SEC 分析;?
OH(二醇基)：穩(wěn)定性欠佳，專為水相 SEC(凝膠過濾色譜)設(shè)計(jì);?
聚苯乙烯基：廣泛應(yīng)用于有機(jī)相 SEC(凝膠滲透色譜)，與水及強(qiáng)極性有機(jī)溶劑兼容性差。?
d、離子交換色譜常用填料?
鍵合相離子交換填料：穩(wěn)定性與重現(xiàn)性較差，逐漸被替代;?
聚苯乙烯基離子交換填料：柱效雖不高，但化學(xué)穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性優(yōu)異，是主流選擇。
發(fā)布于: 2025-12-08